在顯微成像系統(tǒng)中，常常會(huì)用分辨率來(lái)評(píng)價(jià)其成像能力的好壞。這里的分辨率通常是指光學(xué)系統(tǒng)的極限分辨率以及成像探測(cè)器的圖像分辨率。最終圖像所呈現(xiàn)出的實(shí)際分辨率，取決于二者的綜合影響。過(guò)高的光學(xué)分辨率如果沒(méi)有足夠精細(xì)的圖像分辨率來(lái)體現(xiàn)，則實(shí)際分辨率會(huì)降低到圖像分辨率以下；如果相機(jī)解析能力過(guò)高但光學(xué)系統(tǒng)的分辨率低，同樣也看不清物體的精細(xì)結(jié)構(gòu)。所以在選擇相機(jī)的時(shí)候，我們也不妨根據(jù)自己這套系統(tǒng)需要達(dá)到的分辨率來(lái)綜合考慮一下（實(shí)操性的結(jié)論部分請(qǐng)直接移動(dòng)到文章最下方）。

1.光學(xué)系統(tǒng)的分辨率

光學(xué)系統(tǒng)的分辨率，是指"物"在經(jīng)過(guò)光學(xué)系統(tǒng)后的"像"在細(xì)節(jié)上能被分辨的最小距離。一般我們會(huì)用光學(xué)系統(tǒng)所能分辨的兩個(gè)像點(diǎn)的最小距離來(lái)表示，大于這個(gè)距離的兩個(gè)像點(diǎn)就能被識(shí)別為兩個(gè)點(diǎn)，而小于這個(gè)距離的兩個(gè)點(diǎn)經(jīng)過(guò)光系統(tǒng)后就會(huì)被識(shí)別為一個(gè)點(diǎn)。而對(duì)于黑白圖樣（熒光樣品其實(shí)也是一種黑白圖樣）來(lái)說(shuō)，這個(gè)分辨能力也可以用單位距離里內(nèi)能夠分辨的黑白線對(duì)數(shù)來(lái)表示，間隔越寬的黑白條紋越容易分別（想象一下細(xì)胞的Lamellipodia和Filopodia的差別）。

圖一 從"物"到"像"的失真

存在這個(gè)分辨率的原因是因?yàn)楣鈱W(xué)系統(tǒng)的衍射和像差導(dǎo)致從"物"到"像"的過(guò)程中會(huì)發(fā)生"失真"。這種失真是空間上高頻信號(hào)丟失所導(dǎo)致的（光學(xué)系統(tǒng)可以看作是一個(gè)空間上的低通濾波器，只能允許一定帶寬范圍內(nèi)的空間頻率信號(hào)通過(guò)），通俗的理解就是削弱了由"黑"到"白"過(guò)渡的銳度和對(duì)比度，使其變得平滑和模糊。下圖所示，黑白條紋的真實(shí)灰度可以用一個(gè)方波信號(hào)表示。在經(jīng)過(guò)光學(xué)系統(tǒng)之后，如圖像 A 和下方波形所示，原始信號(hào)被"平滑"，方波的每一個(gè)峰都展寬成一個(gè)貝塞爾峰，黑白相交處的信號(hào)變化斜率下降到一個(gè)固定水平（這個(gè)斜率的下降就是以該系統(tǒng)帶寬所做的濾波效果）。當(dāng)我們將原始條紋變的密集（增加空間頻率），該系統(tǒng)仍以固定帶寬進(jìn)行濾波，這樣這些被展寬的峰就會(huì)互相交疊，損失重疊部分的對(duì)比度從而產(chǎn)生圖像B的效果。如果我們換一個(gè)帶寬更寬的系統(tǒng) 2，其信號(hào)的高頻部分會(huì)被更好的保留，表現(xiàn)為黑白交界處的信號(hào)變化斜率更大，對(duì)比度也越接近真實(shí)情況，如圖像 B'。

回歸到我們熟悉的生物熒光成像，上述分辨率的概念通過(guò)瑞利判據(jù)與樣品的發(fā)射光波長(zhǎng)和光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑相聯(lián)系起來(lái)。即在傳統(tǒng)寬場(chǎng)熒光下，光學(xué)系統(tǒng)的極限分辨率 d = 0.6λ/NA，波長(zhǎng)越短，NA值越大，分辨率越高（可以理解為對(duì)空間高頻信號(hào)的保留越充分）。

2. 相機(jī)的圖像分辨率

說(shuō)完了光學(xué)系統(tǒng)的分辨率之后我們來(lái)看看相機(jī)的圖像分辨率。圖像分辨率比較好理解，就是單位距離內(nèi)的像用多少個(gè)像素來(lái)顯示。以我們的ORCA-Flash4.0為例，芯片的像元大小為 6.5 μm，在 40X物鏡的放大倍率下，1 μm的物經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)放大為 40 μm的像，這樣的像會(huì)由 40/6.5 = 6.15 個(gè)像素來(lái)顯示，所以圖像分辨率為 6.15 pixel/μm。反推回實(shí)際物體，則圖像中的一個(gè)像素點(diǎn)表示的實(shí)際距離為 1/6.15 = 162 nm （其實(shí)就是像元尺寸/放大倍數(shù)）。根據(jù)這個(gè)原理，我們可以得出像元尺寸越小，其圖像分辨率越高。

3. 相機(jī)采樣與光學(xué)分辨率的匹配關(guān)系

那么要使整個(gè)系統(tǒng)達(dá)到光學(xué)上的極限分辨率，我們要如何選擇成像系統(tǒng)使其圖像分辨率相匹配呢？ 這里還需要借助上圖中黑白條紋的例子。圖中不管是圖像 A,B還是 B'，其圖像在x方向上的灰度都可以用圖像下方的波形圖來(lái)展示。相機(jī)的芯片則會(huì)在該方向上以像元尺寸為單位距離均勻?qū)η€作積分，得到每個(gè)像素的數(shù)值。這個(gè)過(guò)程就是對(duì)一個(gè)連續(xù)信號(hào)的離散采樣。因?yàn)樾酒系南袼匾怨潭ǖ木嚯x排列，所以這個(gè)采樣在空間上的采樣周期 l 對(duì)應(yīng)的就是像元尺寸（更準(zhǔn)確的說(shuō)是兩像素中心點(diǎn)的間距，因?yàn)樾枰紤]芯片的填充因子），其頻率就是單位距離內(nèi)像素點(diǎn)的個(gè)數(shù)。上述黑白條紋圖樣的空間頻率就是白色/黑色條紋重復(fù)出現(xiàn)的頻率，而其條紋間距就是他們?cè)诳臻g上的周期 d。頻率越高，這個(gè)周期 d 就越短。根據(jù)Nyquist采樣定理（ 詳情請(qǐng)參考網(wǎng)址 ），我們需要以連續(xù)信號(hào)最高頻率的2倍作為離散采樣的頻率，才能剛好還原連續(xù)信號(hào)的特征。因此我們所需要的芯片采樣周期 l，就應(yīng)該小于等于條紋間距 d 的一半。同樣類推到相距很近的兩個(gè)物點(diǎn)也是如此。如此這樣一來(lái)我們就能夠?qū)⒐鈱W(xué)極限分辨率和像元尺寸聯(lián)系在一起了。對(duì)于生物成像系統(tǒng)，光學(xué)上的極限分辨率就是熒光信號(hào)變化的最大頻率所對(duì)應(yīng)的空間周期 d = 0.6λ/NA，因此像元尺寸 l = d × 放大倍數(shù)/2 (注意物點(diǎn)在經(jīng)過(guò)物鏡放大后的像點(diǎn)的距離是d × 放大倍數(shù))。

圖三 "像"的空間頻率和相機(jī)的采樣頻率

1. 已有顯微鏡和相機(jī)，希望知道當(dāng)前成像系統(tǒng)的分辨率究竟是多少

我們可以用木桶理論來(lái)考慮這個(gè)問(wèn)題。光學(xué)系統(tǒng)的分辨率（光學(xué)分辨率）和相機(jī)的圖像分辨率是整個(gè)成像系統(tǒng)分辨率這個(gè)"木桶"上的兩塊"木板"；成像系統(tǒng)的分辨率等于這兩塊"木板"上比較差的那個(gè)。

對(duì)于顯微鏡：

光學(xué)分辨率=0.61*λ/NA。

其中λ為波長(zhǎng)（對(duì)于熒光顯微鏡，就是熒光探針的發(fā)射波長(zhǎng)）；NA為物鏡的數(shù)值孔徑（可以在物鏡上找到）。

舉一個(gè)具體的例子：一臺(tái)熒光顯微鏡，采用NA1.4的63倍油鏡，光路中沒(méi)有其他放大；觀察509nm的綠色熒光樣品。

(1) 采用濱松Flash 4.0相機(jī)，像元大小為6.5 um。其光學(xué)分辨率為：

光學(xué)分辨率 = 0.61*509 nm/1.4 = 222 nm

其相機(jī)的圖像分辨率為：

相機(jī)的圖像分辨率 = 2*6.5 um/63 = 206 nm

比較二者，光學(xué)分辨率較差（即數(shù)值較大），所以整個(gè)系統(tǒng)的分辨率是受限于光學(xué)分辨率的，為222 nm。

(2) 如果采用的是一款11 um的相機(jī)。其光學(xué)分辨率不變，仍為：

光學(xué)分辨率 = 0.61*509 nm/1.4 = 222 nm

但其相機(jī)的圖像分辨率為：

相機(jī)的圖像分辨率 = 2*6.5 um/63 = 349 nm

比較二者，相機(jī)的圖像分辨率較差（即數(shù)值較大），所以整個(gè)系統(tǒng)的分辨率是受限于相機(jī)像素大小的，為349 nm。

2. 已有顯微鏡，希望知道從成像分辨率的角度如何選擇相機(jī)

首先強(qiáng)調(diào)，以下建議僅僅是從成像分辨率的角度。在選擇相機(jī)時(shí)，信噪比常常是更加關(guān)鍵的考量。 像 B'。

我們以GFP的發(fā)射波長(zhǎng) λ = 509 nm為例，在使用不同放大倍率的常用顯微鏡物鏡時(shí)，其光學(xué)極限分辨率和對(duì)應(yīng)的相機(jī)芯片像元尺寸匹配如下表：

原則上來(lái)說(shuō)，實(shí)際選用的像元大小應(yīng)小于理想像元大小，像元越小對(duì)細(xì)節(jié)的解析越好（但是小于理想值的1/2以后就無(wú)顯著性改善了）。

但是從圖像信噪比的角度來(lái)說(shuō)，像元越大能夠得到更高的信噪比。不同相機(jī)除了在像元大小上有所差別，在靈敏度、噪音等方面也是不盡相同。所以在選擇成像系統(tǒng)時(shí)要充分考慮實(shí)際情況來(lái)進(jìn)行多種條件的平衡與取舍。

審核編輯：湯梓紅